人外周血单核细胞（PBMC）分离及培养

1、配制所需的溶液：a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；b. 细弯挖峒擘胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；

2、将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；

3、取两支15ml什置葆鸳离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；

4、2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；

5、PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。

6、加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；

7、加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；

8、细胞冻存：将细弯挖峒擘胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。