融合PCR操作步骤（利用融合PCR连接两个片段）

1、引物设计：需要将A片段的3’端引物含有B片段的一部分，B片段的5’端引物含有A片段的一部分，这样分别扩增获得A和B就含有了互补片段。

如图中第一步中的P2含有一部分B片段序列，P3含有A片段一部分序列

2、分别PCR扩增A和B片段，25μL体系一次扩增8管含有一管阴性对照，切胶回收这两个片段。

如上图第一步，单独扩增A和B片段

3、以A和B两个片段为模板，进行融合PCR实验。融合PCR分为两步，操作步骤如下：

第一步：（不加引物）

dNTPs                                        1μl

10×Buffer                                  2.5μl

Template   DNA （A和B）          各1μl

Taq   酶                                     0.5μl

RNaseA-free   H2O                    19μl

Total                                          25μl

循环参数：95℃预变性 5min，94℃变性 20s、57℃退火 20s、72℃延伸 40s 进行 10个循环，72℃延伸 5min。

如上图第二步：（第一步不需要添加引物，因为让A和B片段具有互补片段，可以互为引物扩增）

4、第二步：10个循环后，取出反应管加入引物。

循环参数：95℃预变性 5min，94℃变性 20s、60℃退火 20s、72℃延伸 40s 进行 10个循环，72℃延伸 5min。待反应完毕后，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。

如上图第三步