病毒灭活试验的准备工作有哪些？

1、试验用病毒与细胞：

试验用病毒株，脊髓灰质炎病毒1型(poliovirus-Ⅰ ,PV-Ⅰ)疫苗株、艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)美国株。宿主细胞，可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL细胞系，作为PV-1的测试细胞。用含有人T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型( human T cell leukemiavirus 1，HTLV-1)基因的人淋巴细胞(MT4株)作为HIV-1的测试细胞。

2、试验用器材：

细胞培养瓶与96孔培养板、恒温水浴箱、二氧化碳培养箱、层流超净工作台、低温冰箱(-20℃，-80℃)、液蚕罐、倒置显微镜、离心机、可调移液器及配套一次性塑料吸头、细胞维持培养基、细胞完全培养基、去离子水；

1、从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心(3000r/min，3min)，去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。

2、取出低温冻存的试验病毒毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。

3、将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或反复冻融）破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心(6000r/min，15min）去除沉淀（主要为细胞碎片)，上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.Oml分装于无菌离心管(1.5ml)中，取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80℃备用。

1、终点稀释法病毒感染滴度的计算

 

以半数细胞感染剂量(TCID50)表示。TCID50的对数值计算公式如下。

 

TCID50对数值=病变率高于50%组稀释度的对数值＋距离比例

2、噬斑法病毒感染滴度的计算

 

噬斑法病毒感染滴度，以噬斑形成单位数（ pfu)，简称噬斑数表示。计数方法同活菌培养计数技术。

 

每毫升测试样品中的病毒含量计算（pfu/ml）=平板平均噬斑数×稀释倍数

3、平均灭活对数值的计算

 

平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为No，试验（消毒)组平均病毒感染滴度（TCI,50或pfu）为Nx。

 

平均灭活对数值= log No—log Nx