沙门氏菌（PCR-荧光探针法）试剂盒检测沙门氏菌

1、1．基因组提取（1）取培养后的菌液约1.5ml，12000rpm离心2min，去上清。（2）加入200μl无菌水，充分混匀，12000rpm离心2min，去上清。（3）加入80μl核酸提取液，用移液器吹吸混匀，50℃水浴1小时，100℃水浴15分钟，冰上放置10分钟后12000rpm离心3min。（4）取上清用于荧光PCR检测。

2、1．动犍呙跳荧光定量PCR检测按下列组份配制反应液（反应液配制请在冰上进行）沙门氏菌荧光PCR反应液： 5.7μlTaq酶： 0.3μl样品DNA或阴阳性对照品： 5μlDEPC H2O： 14μlPCR扩增95℃ 2 min 95℃ 15 sec 60℃ 1 min 荧光检测在60℃，反应体系为25μl，荧光通道选用FAM通道。

3、【结果判读】1，基线的设定对于AB诔罨租磊I系列仪器，分析前把参比荧光定为none，如果没有Ct<16的强阳性标本，就选3-15个循环的平均荧光信号为断芡闽彝基线分析；如果有Ct<16的强阳性标本，就将此标本定为AFUMI DNA>1010 copy/ml，并将此样品从数据库中剔除，再以3-15个循环的平均荧光信号为基线再分析Ct。对于iCycler仪器，基线一般按照自设值（2-10）即可，在实验结束后，选择PCR baseline substract选项扣除基线值。若某些曲线出现了规则的剧烈的跳动，应视为非正常情况，将其从结果中剔除（击活select wells,将此孔彩色点去，然后选择display wells）并注意调整坐标，使所有曲线都在坐标以内。对于lightcycler仪器，用荧光记数值F1/F2读取结果。基线设定原则以超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值不出现任何数值为准（一般在0.001-0.05范围内）。2，阈值的设定应在扩增曲线的指数增长期内且高于阴性对照品的扩增曲线最高点，推荐将阈值设定在从指数增长期转入线性增长期的拐点处。3，结果分析Ct值无任何数值 阴性结果38≤Ct值<40（重新检测2次） 复检2次，Ct值无，阴性结果 复检2次，其中至少1次Ct值<40，阳性结果Ct值<38 阳性结果