太平洋鱈IRF3氨基酸序列比对方法

1、首先，将太平洋鳕IRF3与牙鮃(Paralichthys oliva-ceus)、鲤(Cyprinus carpio)、斑马鱼(Danio rerio)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)的IRF3氨基酸序列进行比对，相似性分别为51%、39%、40%、47%和28%。

2、然后，比对结果显示，在其N端有个保守的DBD结构域，保守的5个色氨酸(W)重复包含于其内。除DBD结构域外在C端还有一个较保守的IRF 关联域(IRF association do-main, IAD)， 且太平洋鳕氨基酸序列中含有13 个与牙鲆、鲤、斑马鱼均不同的氨基酸序列位点。

3、然后，构建系统进化树， 根据NCBI已注册的部分物种不同亚型的IRF(主要为脊椎动物中已报道的IRF1， 1RF2,IRF3, IRF7)的氨基酸序列构建系统发育树。结果显示，不同物种的IRF1、IRF2、IRF3、IRF7明显地各自聚为一支:太平洋鳕IRF3与其他物种IRF3聚为一大支。

4、然后，在IRF3这一大支中，太平洋鳕IRF3单独为一小支，与尼罗罗非鱼亲缘关系相对较近，与哺乳动物IRF3相距较远;鱼类IRF3聚为一支，与其他物种IRF7亲缘关系相对较近，与其他物种IRF1, IRF2相距较远。

5、然后，绝对荧光定量PCR检测IRF3基因，标准曲线的建立，多次重复的PCR产物熔解曲线分析表明，太平洋鳕IRF3基因在设计的引物扩增下的熔解曲线呈较为锐利的单一的峰，无引物二聚体或其他杂峰，扩增IRF3基因的熔解温度在87C左右，可以扩增单的PCR产物，且本实验重复性较好。

6、最后，可以用于荧光实时定量分析IRF3基因的转录水平，所得的标准曲线为:Y=3.3449X+41.001， 其中Y为C值， X为起始的模板数量。标准曲线的回归系数R-=0.9896，这表明标准质粒在稀释的浓度范围内具有良好的线性关系。曲线的扩增效率E -96.261%。