Gateway 体系一步 PCR 法构建 CRISPR 终载体

1、1. PCR 扩增将 OJP001/002 和靶点正反向引物同时加入反应体系中Template 0.2 ulMix 7ulOJP001/002 0.6ulSpac髫潋啜缅er-F/R 0.4ulKOD-FX 0.2ddH2O 1.6ulPCR 反应程序：94℃ 2’ →( 98℃ 10’ →’ 55℃ 20’ →’ 68℃ 1’ ) X 45 cycles → 68℃ 5’ →25℃

2、2. LR 反应PCR 产物（0.4uL） 与 PJE045 做 LR 反应（可以做 1uL 体系） 3h 以上， 电转（热激转化） 。

3、3. 菌春嗉榕石落 PCRU3-temp: OJP008& OJP026 做菌落 PCR（411 bp） ， 提质粒、 OJ霸烹钟爷P026 测序。U6a-temp: OJF320& OJP026 做菌落 PCR（800 bp） ， 提质粒、 OJP026 测序。

4、4.引物信息

5、5.质粒图谱