毕氏酵母感受态细胞制备及转化（法一）

1、感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜钱砀渝测（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）

2、收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；

3、离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；

4、毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；

5、将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；

6、对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/罪焐芡拂ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul

7、剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min犬匮渝扮）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；

8、1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定。