蛋白质的表达、分离、纯化实验
1、实验方法原理携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
2、一、试剂准备 1. LB液体培养基：Trytone 10 g， yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。 2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。 3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。 4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8 M Urea，pH6.3。 5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea， 500 mM Imidazole， pH8.0。 6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
4、三、构建重组表达载体1. 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。2. PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
6、五、氯霉素浚悄防高酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5 mL LB液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），泌驾台佐37℃震荡培养过夜。 2. 按1∶50或1：100的比例稀释过夜菌，一般转接1 mL过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。取10 ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l，37℃继续培养1-3h。 4. 12 000 rpm 离心10 min，弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
