通用植物RNA提取方法及步骤

1、第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!直接研磨法（推荐）:a. 新鲜植物组织称飒劐土懿重后取100mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100mg放入研钵）， 加入1 ml 裂解液RPA室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RPA立刻充分接触以抑制RNA酶活性。b. 将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13,000rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片。c. 取480μl裂解物上清（在不超过RNA吸附柱能力的情况下可以取更多或者全部上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。d. 立刻接操作步骤的步骤3。

2、液氮研惜投赃霞磨法:a. 取500μl裂解液RPA，转入1.5ml离心管中。b. 液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50mg细粉转入上述装有RPA的离心管, 立即用手剧烈振荡20秒，充分脾彩九莪裂解。c. 用吸头吹打混匀帮助裂解或者剧烈涡旋震荡直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。d. 将裂解物13,000 rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片。e. 取裂解物上清（在不超过RNA吸附柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。f. 立刻接操作步骤的步骤3。注意：以上液氮研磨法用户可以根据需要加倍处理，可以提高产量。也就是使用1ml的裂解液RPA和100mg的样品。

3、将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

4、加350μl 去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

5、DNase I工作液配制：取45μl DNase I buffer和5μl RNase free DNase I在离心管轻轻吹打混匀成工作液（处理多个离心柱子要按照比例放大制备工作液）。

6、向吸附柱RA 中央加入50μl 的DNase I 工作液，室温（20-30℃）放置15 分钟。注意直接将工作液滴在膜中央上，不要让工作液滴在O型圈或是离心柱管壁上。

7、向吸附柱RA 中加入350μl去蛋白液RW1， 12,000 rpm 离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

8、加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍。

9、将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10、取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在70-90℃水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

11、如果预期RNA产量>30μg，加30-50μl RNase free water重复步骤10，合并怎剑词阶两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。洗脱两遍的RNA洗脱液RNA浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。注意：如果不需要做荧光定量PCR，仅仅做普通的反转录，克隆基因片段，可以省略DNA酶柱上消化的步骤，具体就是第4步骤的“加350μl 去蛋白液RW1”改成“加700μl 去蛋白液RW1”，同时省略步骤5，6，7。