人脐带间充质干细胞的复苏和培养

1、水浴锅升温至37℃

2、准备好9mL细胞培养液于15mL无菌离心管中，置于37℃水浴锅预热。

3、将冻存管从液氮中取出，置于转移容器中。提示：为了使用安全，可将冻存管放置于干冰上转移；或将冻存管拧松1/4圈，释放内部压力后再拧紧。

4、冻存管在37℃水浴锅内不断摇动，至内容物融化。请仔细观察，待冻存管内容物呈半融状态[Sherry1]，即刻从水浴锅内取出冻存管。提示：尽量避免水没过冻存管盖；融化的时候越短，对细胞的损伤越小。[Sherry1]完全融化，会使原代细胞受损，一般建议原代细胞复苏，不要等到全部融化。

5、用75%酒精消毒冻存管口及外壁，擦拭干净。

6、在无菌工作台内打开冻存管，用1mL移液器轻轻吹匀融化的细胞悬液，取20μL细胞悬液用于计数。

7、其余的细胞悬液全部转入步骤⑵预热的15mL离心管中，轻轻混匀。（为了减少损失的细胞数量，可以用1mL完全培养液，冲洗冻存管，再将1mL涤洗液加入离心管）。

8、将离心管拧紧，放入离心机内。离心机设置离心速度为300g，离心10分钟。

9、离心结束后，无菌工作台内龅歧仲半打开离心管，用移液器尽量去除上清液，向下层沉淀物中加入1mL预热的完全培养液，轻轻吹匀。提示：请尽量减少吹打的次数，一般3-4次即可。吹打过程中，避免气泡的产生。

10、将细胞全部接种到1个100mm培养皿或T25细胞培养瓶中，加入足量的完全培养液，轻轻摇晃、混匀，使细胞均匀分布。

11、将细胞培养容器转入5%CO2，37%，饱和湿度的培养箱中培养。

12、通常培养6-8小时，细胞开始贴壁。

13、复苏后的第2天，显微镜下观察细胞，细胞基本全部贴壁。

14、在无菌工作台内，用移液器弃去培养容器内的培养液，更换为新鲜、37℃预热的完全细胞培养液。

15、培养48-72小时后，细胞融合率达80%，可进行消化和传代。