药物抗肿瘤细胞多药耐药相关研究技术

1、细胞经药物处理后，加入PBS，离心，重悬于含10%FBS培养基中。

2、加入罗丹明-123或柔红霉素，对照组加PBS，37℃暗处孵育1h。（荧光染料与细胞培养后，通过流式细胞仪测定荧光信号强度，可反映细胞内药物浓度，与对照组比较，即检测细胞的药物输出功能，判断细胞的耐药程度。）

3、用冷冻的培养基于4℃离心2次，5min。

4、重悬于冷PBS中，随后用流式细胞仪检测。

1、在预先培养２４ｈ，生长良好的细胞悬液中加入一定量的待测药物，培养２４ｈ后，用ＰＢＳ洗３次，去上清液。

2、加蒸馏水，反复冻融使细胞破裂，混匀，高速离心３０ｍｉｎ，上清液供ＨＰＬＣ分析。

3、ＨＰＬＣ法检测时选择最佳的色谱条件，以待测药物不同浓度的标准液绘制浓度－峰高标准曲线，再检测细胞液，通过标曲，得到药物浓度。

1、取肿瘤细胞，采取异硫氰酸胍－酚－三氯甲烷法提取总ＲＮＡ。

2、含总ＲＮＡ，ＯＬｉｇｏ（ｄＴ）引物，转绿缓冲液，ＲＮａｓｅ抑制剂，逆转录酶逆转录体系中制备ｃＤＮＡ。

3、进行ＰＣＲ，ＭＤＲ１引物，进行３０个循环的变形（９４℃,４５ｓ）－退火（６０℃,４５ｓ）－延伸（７２℃,１ｍｉｎ）。

4、扩增得到的ｃＤＮＡ可用凝胶扫描仪在１.５％琼脂多糖凝胶上以溴化乙锭染色并分析。内参为ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ。

5、用灰度分析软件分析ｍＲＮＡ的表达水平。

1、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ：样品分离转膜杂交，显色检测

2、流式细胞术，检测蛋白含量信息。

1、制备胞质膜，以硫酸亚铁钼蓝显色法测定ＡＴＰ水解产生的磷酸，并做动力学分析。